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1. 裂解液	8mL	8. 陽性對照
2. 蛋白酶K	110μL	9. 0.2 mL 薄壁PCR 管	15個
3. 抽提液	8mL	10. PCR 反應液A	180μL
4. 異丙醇	7mL	11. PCR 反應液B	50μL
5. 洗滌液	12mL	12. 50 倍TAE 電泳緩沖液	20mL
6. 無菌水	500μL	13. 染色液
7. 陰性對照	300μL		10μL

　　注：塑料袋內試劑(陽性對照、蛋白酶K、PCR反應液A和B)-20 ℃凍存，其他室溫保存。

　　黃曲霉毒素M1檢測試劑盒(酶免)

　　三聚氰胺檢測試劑盒(酶免)

　　磺胺二甲基嘧啶檢測試劑盒(酶免)

　　孔雀石綠定量檢測試劑盒(酶免)

　　金霉素定量檢測試劑盒(酶免)

　　【豬偽狂犬病毒實時熒光PCR試劑盒操作方法】

　　一、病毒DNA的提取

　　1.取出已處理的樣品、陰性對照和陽性對照，分別加入600µL抽提液(用抽提液之前不要晃動，不要吸到上層保護液)，用力顛倒10次混勻，12,000rpm離心10min。

　　2.取500µL上清置于滅菌離心管中，加入500µL異丙醇，混勻，置液氮中3min或-70℃冰箱中30min。取出樣品管，室溫融化，13,000rpm離心15min。

　　3.棄上清，沿管壁緩緩加入1mL洗滌液，輕輕旋轉一周后倒掉，將離心管倒扣于吸水紙上1min，再將離心管真空抽干15min或37℃烘干。

　　4.用30µL無菌水溶解沉淀，作為模板備用。

　　二、樣品制備

　　1.樣品采集：病死或撲殺的豬，取大腦海馬背側皮層、中腦、腦橋、扁桃體、淋巴結等組織；待檢活豬，用棉拭子取鼻腔分泌物，置于50%甘油生理鹽水中，或用注射器取血5mL，2～8℃保存。(要求送檢病料新鮮，嚴禁反復凍融。)

　　2.樣品處理：

　　2.1組織樣品的處理：稱取組織0.1g于研磨器中磨碎，再加1mL生理鹽水繼續磨至無塊狀物；然后將樣品轉至1.5mL滅菌離心管中，8000rpm離心5min，取上清100µL于1.5mL滅菌離心管中，加入500µL裂解液和10µL蛋白酶K，混勻后37℃溫育1h。

　　2.2全血樣品的處理：待血凝后取血清放于離心管中，8000rpm離心5min，取上清100µL于1.5mL滅菌離心管中，加入500µL裂解液和10µL蛋白酶K，混勻后37℃溫育1h。

　　2.3陽性對照的處理：混勻后取100µL于1.5mL滅菌離心管中，加入500µL裂解液和10µL蛋白酶K，混勻后37℃溫育1h。

　　2.4陰性對照的處理：混勻后取100µL于1.5mL滅菌離心管中，加入500µL裂解液和10µL蛋白酶K，混勻后37℃溫育1h。

　　三、PCR

　　1.反應體系：分別取16µLPCR反應液A(用前混勻)、2µLPCR反應液B(用前混勻)和2µL模板DNA，混勻。

　　2.反應程序：在PCR儀上運行以下程序：94℃3min；94℃30s、55℃30s、72℃30s，35個循環；72℃延伸10min。

　　四、電泳

　　1.制膠：用50倍稀釋的TAE電泳緩沖液配制1%瓊脂糖凝膠。

　　2.電泳：待膠凝固后，取5µLPCR擴增產物點樣于瓊脂糖凝膠孔中，以5V/cm的電壓于50倍稀釋的TAE電泳緩沖液中電泳。

　　3.染色：取50倍稀釋的TAE電泳緩沖液30mL，加入10µL染色液，混勻后將膠浸泡30min，于紫外燈下觀察結果。

　　【結果判斷】

　　陽性對照出現400bp擴增帶，陰性對照無帶出現(引物帶除外)時，實驗結果成立。被檢樣品出現400bp擴增帶為豬偽狂犬病毒陽性，否則為陰性。

　　【需用但未提供的材料】

　　組織研磨器、眼科剪、眼科鑷、一次性注射器、瓊脂糖、滅菌1.5mL離心管和吸頭(10µL、200µL、1000µL)。

　　【豬偽狂犬病毒實時熒光PCR試劑盒注意事項】

　　1.本試劑盒有效期為6個月，不要使用超過有效期限的試劑，試劑盒之間的組分不要混用。

　　2.所有試劑應在規定的溫度儲存，使用時拿到室溫下，使用后立即放回。

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